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無菌制造業(yè)中的良好操作規(guī)范（GMP）指導(dǎo)在2003年時做了修訂，以調(diào)和來自各種各樣潔凈室標準的不同，建立一個統(tǒng)一的潔凈室標準ISO 14644-1。ISO 14644-1標準介紹如下：
良好操作規(guī)范（GMP）的EC Guide中的附件1為無菌醫(yī)藥產(chǎn)品的GMP應(yīng)用原則和指南提供了指導(dǎo)。它包括為潔凈室的環(huán)境清潔程度標準給出建議。該指導(dǎo)根據(jù)國際標準EN/ISO 14644-1進行評審，并根據(jù)利益平衡修訂，但也特別考慮到了無菌醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)的獨特性。
總的來說，驗證一個潔凈室的方法需要遵守ISO 14644-1的導(dǎo)則和形式；這個歐盟委員會的附件包括應(yīng)用于無菌醫(yī)藥產(chǎn)品的ISO修訂標準。為了支持這項工作，定義了一份潔凈室認證數(shù)據(jù)與ISO 14644-1粗略轉(zhuǎn)換對應(yīng)表。
為明確起見，一系列注意點被附在表中。然而不幸的是，首先，“注意事項 a”就產(chǎn)生了一些歧義。
這一歧義在2008年的時候做了修訂，發(fā)布在EU GMP Annex 1中，明確的列出了需要執(zhí)行的三個階段：
1. 驗證：每個潔凈室和空氣潔 凈設(shè)備都應(yīng)該首先分類。
2. 監(jiān)控：潔凈室應(yīng)該處于監(jiān)控狀態(tài)，需要確認與產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)的生產(chǎn)條件是否一直維持在應(yīng)有水平。
3. 數(shù)據(jù)分析：在監(jiān)控中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，必須根據(jù)對最終產(chǎn)品質(zhì)量可能產(chǎn)生的風(fēng)險進行分析。
驗證
要進行必要的認證，如何理解ISO 14644-1，怎樣依照標準來認證潔凈室，按照規(guī)定的采樣點數(shù)、采樣位置，以及每個采樣點的樣本量來驗證潔凈室，都是非常重要的。潔凈室數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析規(guī)則也都必須遵循標準。然而，與其使用ISO 14644-1中指定的表格進行分類，技術(shù)員應(yīng)該使用這種表格，它印在修訂的指導(dǎo)性文件中。
其他的期望值同樣也由GMP定義，例如，A級潔凈程度的樣本量是指，每個樣本位置取1m3，由于采樣管中有5.0μm的高沉淀粒子，應(yīng)該使用最小長度的采樣管。理想情況下，是不需要使用任何采樣管的。同時，潔凈室的重新認證也應(yīng)該遵守ISO 14644-1所給出的指導(dǎo)，即，每年一次的ISO 6級或是更高，每六個月一次的ISO 5級或更高；如果安裝了監(jiān)控系統(tǒng)，在ISO 5級的擴展區(qū)域可以作適當?shù)淖尣?。認證的恰當時間應(yīng)該是中度負載或模擬全額負載運行時進行。
表1 每立方米的最大粒子數(shù)等于或大于列表中的數(shù)值。
圖：某上海無塵車間
監(jiān)控
在潔凈室或空氣潔凈設(shè)備認證完畢以后，潔凈室必須加以監(jiān)控，相對風(fēng)險而言，證明無菌制造環(huán)境能夠被保持并且一直在保持。
A級區(qū)域?qū)τ谧罱K產(chǎn)品來說，是潛在風(fēng)險最大的環(huán)境，包括設(shè)備在內(nèi)，在整個生產(chǎn)周期中都應(yīng)該監(jiān)控起來。監(jiān)控頻率應(yīng)該確保任何干擾措施、短期事件、或是常規(guī)條件惡化都能被測量出來，并且在超出警報/動作限制的時候能夠觸發(fā)警報。所有的這些事件都必須排除由于進行連續(xù)采樣而在這些區(qū)域采用多聯(lián)取樣影響。如果經(jīng)過充分驗證，采用的多聯(lián)取樣適合相關(guān)制造類型，那么在采用多支管的情況下，可以做出一些讓步。
B等級區(qū)域遵守的規(guī)則和A等級區(qū)域的規(guī)則一樣。但是，采樣頻率可以降低。A等級靠單向氣流維持，因此，除了災(zāi)難，突發(fā)事件應(yīng)該局部化并且持續(xù)時間非常短。然而，B等級是紊亂的混合氣流，是操作員所處的普通環(huán)境。這個區(qū)域中，粒子持續(xù)低水平活躍是正常的；只有在該區(qū)域的常規(guī)控制超出容忍范圍時，系統(tǒng)才會響應(yīng)，發(fā)出警報。因此，突發(fā)性污染對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生重大影響的可能性很小。
2003年的GMP，由于措詞使用的問題，監(jiān)控A等級區(qū)域和B等級區(qū)域的采用要求出現(xiàn)了混淆。1m3符合ISO 14644-1的計算要求，但卻并不基于風(fēng)險監(jiān)控值。不過，修訂后的指導(dǎo)有了明顯的改善：
使用自動化系統(tǒng)得到的監(jiān)控樣本大小通常是系統(tǒng)使用的取樣率的函數(shù)。樣本量沒有必要和潔凈室或潔凈空氣設(shè)備的正式分類一樣。
因此，使用28.3 L/min 粒子計數(shù)器的系統(tǒng)就可以理想地持續(xù)采樣，從啟動到整個罐裝階段并略微延長，每分鐘采樣一次，將數(shù)據(jù)標準化為多少粒/m3，并在標準化的數(shù)值上設(shè)置適當?shù)膱缶透婢撝?。監(jiān)控的關(guān)鍵在于能夠?qū)κ录龀黾皶r響應(yīng)，顯示出該區(qū)域不再處于環(huán)境控制中。
數(shù)據(jù)分析
潔凈室中非可存活粒子和可存活微生物粒子之間存在著一定的聯(lián)系（見USP Chapter <1116>，“潔凈室及其他受控環(huán)境的微生物評估”）。也有研究指出潔凈室中自由懸浮的可存活微粒的大小。當將這兩個獨立的研究結(jié)合在一起，如果工作人員能夠控制潔凈室中的大粒子，就可以控制潔凈室中生物污染風(fēng)險。照常來說，由于統(tǒng)計的數(shù)值非常?。?/font><1粒子或<1CFU），這很難得出結(jié)論。但是，當分析潔凈室內(nèi)部的環(huán)境數(shù)據(jù)時，5.0μm大小的粒子就顯得特別重要。
偶爾產(chǎn)生高計數(shù)的原因可能是由于電子粒子計數(shù)器的干擾，盡管一些粒子計數(shù)器具有一些元件，能夠減少這樣的干擾影響，并降低潔凈室中隨機粒子的影響。鑒于一個事實，即，在統(tǒng)計分析中，隨機事件不能用小數(shù)值來解釋，并且與一般的生產(chǎn)活動沒有什么相關(guān)性，當做潔凈室性能的長期分析時，這些是可以放在最后階段來分析的。比較關(guān)鍵的是，連續(xù)或是規(guī)律的低級別粒子計數(shù)，這些可能會給出一定的線索，指向需要調(diào)查的可能存在的污染。
圖1 潔凈室日常變化趨勢。
圖1顯示無菌室-無塵室-無塵車間
● 連續(xù)：如果在潔凈室中持續(xù)出現(xiàn)等級為5.0-μm的粒子，應(yīng)該采取一些調(diào)查工作，因為大的粒子不能穿透過濾器。因此，污染可能發(fā)生環(huán)境內(nèi)部的某個點上。
● 頻繁：當頻繁產(chǎn)生大的粒子
而非隨機時，應(yīng)該確定這些粒子的來源，可能在哪里存在，并做出調(diào)整。粒子的影響與最終產(chǎn)品的測試相聯(lián)系，定義出什么等級的粒子是有害的。
● 隨機：當粒子幾乎不可能或根本沒有產(chǎn)生的可能時，應(yīng)該確定頻率N/M，例如，在任意12分鐘內(nèi)或是類似的情況下，不多于3個粒子。另外，應(yīng)該與最終產(chǎn)品測試相關(guān)聯(lián)，確認常規(guī)監(jiān)控的數(shù)據(jù)。
報警和警報設(shè)置點的定義，在目前的GMP導(dǎo)則中同樣有分析：
對于粒子和微生物的監(jiān)控結(jié)果，應(yīng)該設(shè)置適當?shù)膱缶蛣幼鏖撝怠Ｈ绻隽诉@些閾值，就需要指明糾正措施。
適當?shù)膱缶撝?，是根?jù)與產(chǎn)品質(zhì)量相關(guān)的、需要保持的控制環(huán)境來確定的。因此，單獨采用驗證數(shù)據(jù)得出來的閾值并不一定就是穩(wěn)妥的。更恰當?shù)恼f，閾值可以更好地反映出每個特殊設(shè)備、罐裝線或是類似設(shè)施設(shè)的生產(chǎn)環(huán)境。
這個指南是為使用現(xiàn)場粒子計數(shù)器的A等級和緊鄰B等級區(qū)域中的連續(xù)粒子監(jiān)控所服務(wù)的。這是因為，最終產(chǎn)品的污染風(fēng)險是很高的，并且與最大的風(fēng)險因素——操作員，是緊密相連的。不僅僅是操作員構(gòu)成了產(chǎn)品的最大風(fēng)險，同樣的隨機產(chǎn)生的粒子也是最大的風(fēng)險。這些不全是惰性粒子；有一些是可存活的，這就對最終產(chǎn)品構(gòu)成了更大的風(fēng)險。由于我們不能控制風(fēng)險，我們就必須測量它。如果它在可以接受的閾值之外，系統(tǒng)則必須給用戶發(fā)出警報。設(shè)備監(jiān)控系統(tǒng)如何為用戶實現(xiàn)快速報警，取決于風(fēng)險（見“A等級區(qū)域推薦系統(tǒng)設(shè)置”）。
風(fēng)險分析可以看作是如何使罐裝操作具有復(fù)原力，在有潛在污染事件的同時，仍然能夠保護產(chǎn)品。如果系統(tǒng)十分穩(wěn)健（絕緣、限制進入屏蔽系統(tǒng)），那么，出現(xiàn)事件會有一個相對較低的污染風(fēng)險。如果安瓿線具有幕簾保護，那么微小的偏差就可能帶來很大的影響。沒有一個適合所有應(yīng)用的答案，因為，所有的風(fēng)險都是一個變數(shù)。一些考慮因素，諸如應(yīng)該穿什么、因該提供什么樣的內(nèi)衣、每小時的空氣變換、房間中的員工數(shù)目等等，都是至關(guān)重要的。
凍干產(chǎn)品
對于無菌罐裝需要進行冷凍干燥的產(chǎn)品，從塞子的插入點到冰凍干燥機都應(yīng)該維持A等級環(huán)境。如果這是在一個移動推車中實現(xiàn)的，那么這個移動的環(huán)境也必須維持A等級環(huán)境。當塞子沒有完全插入，小瓶就被認為是打開的，任何無菌瓶子的打開環(huán)境必須維持在一個可控制的環(huán)境下。
一旦冷凍干燥完成后，塞子塞入瓶中或是用機械壓力保證封閉，塞子要通過一定的驗證方案保證完全密封，小瓶應(yīng)該保持處于A等級的空氣中，直到蓋帽蓋在適當?shù)奈恢貌⒕o固。重新回顧驗證過程中的表格：A等級A環(huán)境是一個ISO 5級的環(huán)境。因此，從粒子觀點來看，壓接處理過程中提供的空氣質(zhì)量應(yīng)當是ISO 5級品質(zhì)。如果蓋帽行為在無菌處理中執(zhí)行，那么必須是A等級環(huán)境。
A等級區(qū)域推薦監(jiān)控/警報系統(tǒng)設(shè)置
第一步：將設(shè)備監(jiān)控系統(tǒng)的所有值設(shè)為m3
第二步：設(shè)置0.5μm報警通道（1=警告, 3=報警）到1625和3250 n/m3。（這些值是臨時值，直到從工藝中發(fā)現(xiàn)真實值。）
第三步：設(shè)置1級報警（警告0.5μm）反應(yīng)頻率為2:2事件。因此，兩個連續(xù)事件將觸發(fā)一個警告= 橙色燈。
第四步：設(shè)置3級報警（0.5 μm報警）反應(yīng)頻率3:3事件。因此三個連續(xù)事件觸發(fā)一個報警 = 紅燈。
第五步：設(shè)置5.0-μm報警通道（0 =警告，2 = 報警）到71和35n/m3。（這些是一樣的，但是我們將用不同的頻率來確定風(fēng)險。）
第六步：設(shè)置0級報警（ale警告5.0μm）反應(yīng)頻率2:2事件。因此兩個連續(xù)事件觸發(fā)一個警告 = 橙色燈。
第七步：設(shè)置2級報警（5.0μm報警）反應(yīng)頻率3:10事件。因此三個連續(xù)事件觸發(fā)一個報警=紅燈。
這個基本原理要求技術(shù)員迅速對0.5μm事件做出響應(yīng)，但是對于擾動不報警——在面臨非常小的威脅的時候，非常短暫的事件可能會超出報警閾值。這也允許技術(shù)員將5.0μm報警當作一個基于事件而不是基于粒子數(shù)的方法看待。ISO 14644-1給出了一個實證，即，5.0μm水平上升，相應(yīng)的0.5μm的改變就將會發(fā)生[(0.1/D)^2.08]。因此，如果它對于環(huán)境是重要的，那么技術(shù)員會知道，因為這同樣也會觸發(fā)0.5μm通道。如果它對微生物是重要的，那么將會觸發(fā)5.0μm通道。
使用這個方法三到六個月以后，技術(shù)員應(yīng)該回顧最終產(chǎn)品的質(zhì)量記錄、可存活粒子采樣記錄、報警事件數(shù)量，并應(yīng)用指導(dǎo)方針，讓系統(tǒng)對這些發(fā)現(xiàn)進行處理。
應(yīng)該指出的是，1m3值是僅僅利用一個便攜式粒子計數(shù)器來達到驗證目的的。這種計數(shù)器是為常規(guī)測試而特別設(shè)計的。
注意：系統(tǒng)常常會為這個指導(dǎo)方針提供一個基礎(chǔ)，如從Particle Measuring Systems中得到的Airnet、IsoAir PLUS、Lasair II、以及LasairIII。